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    ELISA 實驗方案

    備注:參照大鼠P選擇素(P-Selectin)ELISA試劑盒

    實驗原理:

       本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠P選擇素(P-Selectin)水平。用純化的大鼠P選擇素(P-Selectin)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入P選擇素(P-Selectin),再與HRP標記的P選擇素(P-Selectin)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的P選擇素(P-Selectin)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中大鼠P選擇素(P-Selectin)濃度。

    試劑盒組成:

    試劑盒組成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    說明書

    1

    1

     

    封板膜

    2片(48

    2片(96

     

    密封袋

    1

    1

     

    酶標包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    標準品:36ng/L

    0.5ml×1

    0.5ml×1

    2-8℃保存

    標準品稀釋液

    1.5ml×1

    1.5ml×1

    2-8℃保存

    酶標試劑

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    樣品稀釋液

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    顯色劑A

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    顯色劑B

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    終止液

    3ml×1

    6ml×1

    2-8℃保存

    20倍濃縮洗滌液

    20ml×1

    20ml×1

    2-8℃保存

     

    樣本處理及要求:

    1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

    2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

    3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

    4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBSPH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

    5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

    6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.

    7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

     

    操作步驟:

    1.   標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標準品100μl,然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為24ng/L,16ng/L ,8ng/L,4ng/L, 2ng/L)。

    2.   加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

    3.   溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

    4.   配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

    5.   洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

    6.   加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

    7.   溫育:操作同3。

    8.   洗滌:操作同5。

    9.   顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.

    10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

    11. 測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

     

    注意事項:

    1.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

    2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

    3.各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。

    4.請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。

    5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    6.底物請避光保存。

    7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

    8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

    9.本試劑不同批號組分不得混用。

    10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

     

    以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,   

    在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD                  

    值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋     

    倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標     

    準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD      

    代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

    倍數,即為樣品的實際濃度。                 

     

    (此圖僅供參考)

     


    試劑盒性能:

    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990以上。

    2.批內與批見應分別小于9%11%


    檢測范圍:                                             

    1ng/L -30ng/L                                        

                               

    保存條件及有效期:

    1.試劑盒保存:;2-8℃。

    2.有效期:6個月



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